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OCT冰凍切片包埋劑(O.C.T. Compound)

OCT冰凍切片包埋劑是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已廣泛用于免疫組化實驗中，其用途是在冰凍切片時支撐組織，以增加組織的連續(xù)性，減少皺折及碎裂。又回OCT混合物為水溶性，故在漂片時可溶于水，所以在以后的染色中不會增加背景染色。利用OCT混合物（opti-mum cutting temperature compound）預(yù)先浸潤組織，然后再進(jìn)行恒冷箱切片，使切片質(zhì)量得到改善。

OCT包埋劑（SAKURA產(chǎn)品，MADE IN USA）包埋流程：

1，將放在蔗糖溶液中的組織塊取出，放入20g　L-1　蔗糖與OCT包埋劑1：1體積比例混合液中，室溫浸泡2h

2，移入OCT包埋劑中室溫浸泡4h，更換新的OCT包埋劑，室溫浸泡6h.

3，將標(biāo)本置于托物臺，用恒冷箱切片機(jī)切片（一般－22℃），片厚10μm,貼于預(yù)處理的載玻片上，－20℃冰箱保存。

組織采樣

1.從每個福爾馬林固定石蠟包埋的標(biāo)本上切下50 µm的切片。每塊標(biāo)本至少要有兩個切片，如果需要更多的細(xì)胞，則增加切片數(shù)量。每次從組織塊取樣之前和之后，按照5µm大小進(jìn)一步分割，分出正常和惡性組織。

2.將分開的小切片放入10 mL管中。給管子貼上編號和「正常」「腫瘤」等標(biāo)識

脫蠟

注意：在化學(xué)通風(fēng)櫥中執(zhí)行以下脫蠟步驟。

1.通過向管中加入至少2至3 mL AmeriClear【AmeriClear histology clearing solvent (Scientific Products Cat. No. C4200-1)】，開始對切片進(jìn)行脫蠟或脫蠟處理。在孵育步驟中，應(yīng)有足夠的試劑*覆蓋石蠟切片。

2.劇烈渦旋震蕩樣品。與AmeriClear孵育的時間大約為10至15分鐘，長為3小時。在移除試劑之前，請用移液管小心地將切片向上拉到試管的側(cè)面，以保持組織完整。吸出剩余的試劑。

3.再加入2至3 mL AmeriClear，短暫渦旋，然后孵育10分鐘。確保組織切片被試劑覆蓋。流程如上所述。在進(jìn)行復(fù)水步驟之前，請檢查每個管子是否透明，這表明石蠟已*溶解。

復(fù)水

以下步驟對于組織的適當(dāng)復(fù)水至關(guān)重要，如果執(zhí)行不正確，可能會導(dǎo)致樣品制備過程中碎屑增加。注意：在執(zhí)行一個復(fù)水步驟時，如果酒精看起來渾濁或有明顯的蠟沉淀存在，請通過在AmeriClear中孵育30分鐘以除去殘留的石蠟來除去酒精并執(zhí)行額外的脫蠟步驟。然后繼續(xù)補(bǔ)液步驟。

1.使用以下每種乙醇溶液3 mL：100％，95％，70％和50％的順序洗滌，對切片進(jìn)行復(fù)水。加入每種新的乙醇溶液后，渦旋標(biāo)本，并在室溫（20°至25°C）下孵育至少10分鐘。在添加下一個溶液之前，先吸出每種溶液，在移液之前將切片向上拉到試管的側(cè)面，以保持組織切片的完整性。注意：如果組織脆或很小，則可能很難將組織拉到管壁上。必須注意防止過多的細(xì)胞丟失。

2.加入3 mL純水完成復(fù)水。輕輕吸取殘留液體并加入純水以消除殘留的酒精。在室溫（20°至25°C）下，將組織放在水中過夜。

解離

1.輕輕吸去純水并重懸于2 mL 1X PBS中，同時準(zhǔn)備胃蛋白酶（10分鐘）。

2.輕輕吸出1X PBS，并在每個試管中加入至少2 mL新鮮制備的0.5％胃蛋白酶溶液。以中等速度渦旋約30秒，以確保組織被重懸。

3.將試管在37°C水浴中孵育1小時。每10分鐘搖動或輕輕搖動試管一次，并檢查上清液的濁度。對于某些組織，可能需要更長的孵育時間以增加細(xì)胞的回收率。一些組織，例如脾臟和淋巴結(jié)，可能只需要20分鐘即可使上清液變渾濁。這也將取決于酶的活性。

染色

1.通過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，用1-2 mL的1X PBS沖洗樣品管一次，然后倒入濾網(wǎng)中。用尖頭鑷子擠壓濾網(wǎng)以增加細(xì)胞產(chǎn)量。

2.在室溫下（20°至25°C）以400 x g離心細(xì)胞懸液5分鐘。小心除去上清液。

3.輕輕地將細(xì)胞沉淀重懸于1 mL的1X PBS中，并使用光學(xué)顯微鏡在血球計數(shù)器中計數(shù)細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)整至大5.0 x 10E5細(xì)胞/mL。